抗胰蛋白酶测定试剂盒的使用方法

抗胰蛋白酶测定试剂盒的使用方法因试剂盒类型（如ELISA试剂盒、活性检测试剂盒）及检测对象（人源、小鼠源、大鼠源样本）的不同而有所差异，但核心步骤通常包括样本处理、试剂准备、加样、温育、洗涤、显色与终止、结果测定与计算。以下为通用操作步骤及注意事项：

一、样本处理

血清/血浆：

使用不含热原和内毒素的试管收集血液。

血清样本：室温放置2小时或4℃过夜后，1000×g离心20分钟，取上清。

血浆样本：用EDTA或肝素作为抗凝剂，采集后30分钟内于2-8℃、1000×g离心15分钟，取上清。

避免溶血和高血脂血，若血清中有颗粒，需离心或过滤。

组织匀浆：

用预冷的PBS（0.01M，pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液。

称重后剪碎组织，按1:9（重量体积比）加入PBS（可加入蛋白酶抑制剂）。

于冰上充分研磨，或进行超声破碎、反复冻融以裂解细胞。

5000×g离心5-10分钟，取上清检测。

细胞上清液：

1000×g离心20分钟，取上清。

若检测细胞内成分，需用PBS稀释细胞悬液至100万/ml左右，反复冻融后离心取上清。

保存：

若不立即使用，样本应分装后于-70℃保存，避免反复冻融。

解冻时应在室温下进行，确保样本均匀充分解冻。

二、试剂准备

试剂盒组成：

包括酶标板、标准品、样本稀释液、检测抗体-HRP、洗涤缓冲液、底物A、底物B、终止液等。

不同试剂盒的组分可能有所不同，需根据说明书准备。

试剂配制：

洗涤缓冲液：按说明书比例用蒸馏水稀释（如1:20或1:50）。

标准品：按说明书进行系列稀释，现用现配，不可储存。

其他试剂：如生物素标记的抗体、亲和链酶素-HRP等，通常为即用型。

三、加样

设置标准品孔和样本孔：

标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

加样注意事项：

加样时尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

若样本浓度过高，需用样本稀释液稀释后再加样，计算时乘以相应稀释倍数。

四、温育

温育条件：

除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL。

用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟（具体时间根据试剂盒说明书调整）。

温育注意事项：

确保所有试剂在使用前达到室温（20-25℃）。

温育过程中不要让微孔干燥掉。

五、洗涤

洗涤步骤：

弃去液体，吸水纸上拍干。

每孔加满洗涤液（350μL），静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。

重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

洗涤注意事项：

洗涤不充分会导致精确度误差及OD值错误地升高。

在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。

六、显色与终止

显色：

每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分钟（具体时间根据试剂盒说明书调整）。

底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

终止：

每孔加入终止液50μL，15分钟内（具体时间根据试剂盒说明书调整），在450nm波长处测定各孔的OD值。

终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。

七、结果测定与计算

测定OD值：

用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度（OD值）。

测定应在加终止液后立即进行。

计算样品浓度：

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程。

将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

若样本稀释过，需乘以相应稀释倍数得到实际浓度。