B因子测定试剂盒的制作注意事项

B因子测定试剂盒在制作过程中，需关注试剂配制、稳定性控制、操作规范及安全防护四大核心环节，具体注意事项如下：

一、试剂配制与稳定性控制

缓冲液制备

需精确控制pH值（如CHES-TAPSO-MES缓冲液pH6.86或7.25），使用氢氧化钠或盐酸调节时需逐滴加入，避免pH波动影响试剂活性。

缓冲液成分（如LiCl、CaCl₂、NaCl）需按比例溶解，搅拌至完全透明后定容，防止结晶析出。

抗体与胶乳颗粒处理

兔抗人B因子多克隆抗体包被胶乳颗粒时，需严格控制温度（如25℃振荡4小时）和抗体浓度（60-100mg），避免包被不均导致灵敏度下降。

增敏剂（含PEG6000/10000）需分步溶解（25℃→45℃→37℃），确保聚乙二醇完全分散，防止团聚影响反应效率。

防腐与抗干扰设计

防腐剂（如叠氮钠）需按0.02%-0.05%浓度添加，抑制微生物生长的同时避免抑制酶活性。

抗干扰剂（含BSA、阻断剂）需在40℃搅拌溶解，去除血清中类因子、补体等内源性干扰，提升检测特异性。

二、操作规范与误差控制

加样精度管理

使用多道移液器加样，误差范围需控制在±1%以内，避免因加样量偏差导致标准曲线失真。

封板膜仅限一次性使用，防止交叉污染；洗涤液需按1:50比例稀释，洗板次数严格控制在3-5次，避免残留影响显色。

温育条件优化

酶标板温育需采用水浴或湿盒，保持37℃恒温，减少边缘效应（96孔板周边孔与中心孔温差≤0.5℃）。

显色反应时间需精确至分钟（如TMB底物避光反应15分钟），超时会导致OD值虚高。

标准曲线绘制

标准品需现用现配，稀释梯度（如12.5ng/mL→400ng/mL）需覆盖检测范围，复孔OD值变异系数（CV）应≤5%。

线性回归方程相关系数（R²）需≥0.99，确保定量准确性。

三、安全防护与废弃物处理

个人防护装备

操作时需佩戴护目镜、防割手套、实验服，防止试剂溅入眼睛或接触皮肤。

终止液（含2M H₂SO₄）和底物B（含TMB）具有腐蚀性，接触后需立即用大量清水冲洗。

生物安全要求

所有样本、洗涤液和废弃物需按传染物处理，高压灭菌（121℃, 30分钟）后丢弃。

含NaN₃的样本禁止检测，因NaN₃会抑制HRP酶活性，导致假阴性结果。

储存条件管理

试剂盒需避光保存于2-8℃，开封后板条需密封保存，48小时内使用完毕。

长期保存需分装至-70℃，避免反复冻融（≤3次），防止蛋白变性。